Главная Обратная связь Поможем написать вашу работу!

Дисциплины:

Архитектура (936)
Биология (6393)
География (744)
История (25)
Компьютеры (1497)
Кулинария (2184)
Культура (3938)
Литература (5778)
Математика (5918)
Медицина (9278)
Механика (2776)
Образование (13883)
Политика (26404)
Правоведение (321)
Психология (56518)
Религия (1833)
Социология (23400)
Спорт (2350)
Строительство (17942)
Технология (5741)
Транспорт (14634)
Физика (1043)
Философия (440)
Финансы (17336)
Химия (4931)
Экология (6055)
Экономика (9200)
Электроника (7621)






Стандартные методы разжижения и деконтаминации



Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал помещают собирают в стерильные флаконы со стеклянными бусами или битым стеклом, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию.

 

Все процедуры по переносу материала из одной посуды в другую при обработке и посеве производятся только стерильными пипетками. Запрещается перенос материала путем переливания его через край флаконов, пробирок и пр.
Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок.

 

Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ).Могут использоватьсякакотечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень очистки не менее, чем "химически чистый".

Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.

 

1.1.1. Обработка материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-х-дневном хранении материала при +40С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6-8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Флакон с материалом поместить на 18 - 20 часов в термостат при 37°C.

3. После этого материал стерильной пипеткой объемом 5 — 10 мл перенести в пробирки, уравновесить их и центрифугировать при 3000 х g[2]2 в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

 

_________________

2 Ускорение центрифугирования («относительная сила центрифугирования» (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения «g». Формула расчета ОСЦ:



ОСЦ=1,12 Rmax (об/мин / 1000)2 , где Rmax – максимальный радиус от центра вращения ротора до дна пробирки в мм.

Например, при R=180 мм и 1500 об/мин (центрифуга ЦЛ1-3) ОСЦ=450 g. При увеличении частоты вращения до 3000 об/мин ОСЦ возрастает до 1800 g.

Необходимое число оборотов в мин. можно рассчитать по формуле:

Об.мин-1 = 1000√ ОСЦ / (1,12 R max))

 

 

4. Надосадочную жидкость отобрать стерильной пипеткой на 10 – 5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

5. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

6. К осадку стерильно добавить несколько капель 6% соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

7. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить ее в штатив в порядке регистрационных номеров материала.

8. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов) вводят еще одну процедуру отмывки 10-15 мл дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл готовят к инокулированию и приготовлению мазка.

Далее см. разделы 2.1 Процедура посева и 2.2. Инкубация и др.

Реактивы.

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) – ГОСТ 4274 - 76;



Кислота соляная (HCl) концентрированная – ГОСТ 3118 – 77;

Бумага индикаторная универсальная – ТУ 6-09-1181-76.

Приготовление растворов.

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.

2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл дистиллированной воды.

Никогда не добавлять воду в кислоту !

 

1.1.2. Обработка материала 3% серной кислотой

Несмотря на то, что микобактерии туберкулеза не теряют жизнеспособностьи в сильно закисленной среде, необходимо помнить, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии. Поэтому раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендован для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.

При обработке 3% раствором серной кислоты рекомендуется следующий порядок манипуляций:

1. Для работы правильно собранный материал (60 —100 мл) используют целиком для получения осадка, так как микобактерии, имея удельный вес близкий к 1?,0, могут подолгу не оседать, находясянаходясь во взвешенном состоянии.

2. Из этого материала методом наслоения поэтапным центрифугированием получить осадок. Для этого перенести в 1 - 2 центрифужные пробирки приблизительно по 15—20 мл материала.

3. Уравновесить пробирки и центрифугировать материал при 3000 х g в течение 15 мин.

4. Надосадочную жидкость отобрать пипеткой на 10 – 5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 0,8-1,2 мл осадка.

5. Полученные в разных пробирках осадки одного и того же материала с помощью той же стерильной пипетки перенести в одну пробирку, плотно закрыть ее пробкой и встряхнуть.



6. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

7. К полученному осадку добавить равный объем 3% раствора серной кислоты.

8. Выдержать полученную с кислотой смесь 10 мин при комнатной температуре (не превышать время экспозиции!).

9. Центрифугировать смесь при 3000 g в течение 10 мин (не превышать время экспозиции!).

10. Стерильной пипеткой на 5 – 10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 0,8 – 1,2 мл осадка.

11. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 0,9 % раствора хлористого натрия.

12. Пробирки уравновесить и повторно отцентрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

13. Стерильной пипеткой на 5 – 10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 1,5 мл осадка.

14. Добавить в пробирку 1 - 2 капли 4% едкого натра до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

15. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Далее см. разделы 2.1 Процедура посева и 2.2. Инкубация и др.

Реактивы:

1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная — ГОСТ 4204 – 77;

2. Едкий натр (NaOH) — ГОСТ 4328 – 77;

Приготовление растворов

1. 3% раствор серной кислоты.К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда.

ВНИМАНИЕ ! Кислоту следует добавлять в воду, а не наоборот!

Не пипетируйте концентрированную серную кислоту ртом!

2. 4% раствор едкого натра.40 г NaOH заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

 

1.1.3. Обработка материала 4% раствором едкого натра
(модифицированный метод Петрова)

Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов.

Гидроокись натрия токсична по отношению, как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза.

 

Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6–8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить двойным объемом 4% раствора едкого натра и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Выдержать полученную со щелочью смесь 15 мин при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием (не превышать время экспозиции!).

3. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести обработанный материал в пробирки.

4. Пробирки уравновесить и центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

4. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в пробирке 0,8 — 1,2 мл осадка.

5. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 0,9 % раствора хлористого натрия.

6. Пробирки уравновесить и повторно отцентрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

7. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в пробирке 1,2 — 1,5 мл осадка.

8. К осадку добавить 1 – 2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

9. Закрыть пробирку и встряхнуть ее содержимое.

10. Пробирку с осадком поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Реактивы.

1. Едкий натр (NaOH) – ГОСТ – 4328 – 77;

2. Кислота соляная (HCl) концентрированная – ГОСТ 3118 – 77;

Приготовление растворов.

1. 4% раствор едкого натра.40 г едкого натра заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды.

Растворы стерилизуют 20 мин при 1 атмосфере.


Просмотров 466

Эта страница нарушает авторские права




allrefrs.ru - 2021 год. Все права принадлежат их авторам!