Главная Обратная связь Поможем написать вашу работу!

Дисциплины:

Архитектура (936)
Биология (6393)
География (744)
История (25)
Компьютеры (1497)
Кулинария (2184)
Культура (3938)
Литература (5778)
Математика (5918)
Медицина (9278)
Механика (2776)
Образование (13883)
Политика (26404)
Правоведение (321)
Психология (56518)
Религия (1833)
Социология (23400)
Спорт (2350)
Строительство (17942)
Технология (5741)
Транспорт (14634)
Физика (1043)
Философия (440)
Финансы (17336)
Химия (4931)
Экология (6055)
Экономика (9200)
Электроника (7621)






Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl - Neelsen



Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее употребляемым и распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

· окраска фуксином (с подогреванием) — при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;

· обесцвечивание (3 мин.) — последующая обработка мазка 25% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;

· контрастирующая окраска (1 мин.) — обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату.

2.1.1. Оборудование и реактивы для окраски
по методу Ziehl -Neelsen

Для окраски мазков по методу Ziehl - Neelsen необходимы:

— Раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

— Специальный штатив («рельсы») для окраски мазков на предметных стеклах;

— Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

— Газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата (если мазки не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания его при окрашивании карболовым фуксином; или

— Металлический стержень для приготовления с ватногоым тампонаом, который используется вместо горелки для подогревания препарата при окрашивании карболовым фуксином;

— Фильтровальная бумага размером ~ 4 х 1,5 см для окраски мазков карболовым фуксином;

— Раствор карболового фуксина;

— 25% раствор серной кислоты или



— 3% раствор солянокислого спирта;

— Дистиллированная вода для промывания мазков;

— 0,3% раствор хлорида метиленового синего;

— Штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

Реактивы:

· Спирт этиловый марки 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

· Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

· Кислота серная концентрированная, ГОСТ -4204-77;

· Фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

· Фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;

· Метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

· Глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;

· Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

2.1.3 Приготовление растворов:

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

— растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96о этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):

— расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола – 410С). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

— в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.



Никогда не добавляйте воду в кислоту!

б) Раствор солянокислого спирта

Вместо раствора серной кислотыдля обесцвечивания можно использовать 3% солянокислый спирт:

Этиловый спирт 96о 97 мл

Концентрированная соляная кислота 3 мл

К 97 мл спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот !

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

— растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Хранение растворов. Все приготовленные растворы должны быть профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста, готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре, в темном месте.

Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более 2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в осадок, что изменяет заданные свойства раствора.

Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении. Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть уверенным в качестве используемых красителей.

2.1.3 Процедура окраски:

— убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и промаркированы;

— препараты помещают на подставку («рельсы») так, чтобы они не касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные «рельсы» помещают не более 12 стекол;

— на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии;



— наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее;

— пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;

— осторожно (!) смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. При промывании мазков следует использовать холодную воду или воду комнатной температуры.

— перед тем, как нанести на стекло следующий раствор, щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление следующего реактива;

— мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;

— мазок тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение до 1 минуты (не превышать экспозицию!) 0,3% раствором метиленового синего;

— вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода;

— высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Не следует промокать препарат!

В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы — в голубой.

При использовании 0,3% раствора метиленового синего для окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот краситель может как бы «скрыть» кислотоустойчивые микобактерии.

Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным солянокислым спиртом.

Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.

 


Просмотров 905

Эта страница нарушает авторские права




allrefrs.ru - 2021 год. Все права принадлежат их авторам!