ІV день Облік та оцінка результатів

Якщо виділена культура то: грам додатні коки з додатною каталазою містить фермент плазмокоагулазу, утворюють гемоліз на кров’яному агарі, мають лецитиназну активність , розщеплюють маніт- це дозволяє диференціювати золотисті стафілококи ( S. aureus) від стафілококів інших видів.

БІОЛОГІЧНА ПРОБА:

Беруть кроля, збоку або на спині вискубують шерсть і вводять внутрішньошкірно 0,2 мл двомільярдної засіви стафілококової культури в ізотонічному розчині NaCl. При наявності у виділеній культурі некротичних властивостей на місці введення утворюється інфільтрат і некроз. Реакцію враховують через 18-24год

МОРФОЛОГІЯ СТРЕПТОКОКА: грам додатні, сферична, овальна, шаровидна форми, розташовуються ланцюжками (діляться в одній площині), спор не утворюють, капсули не мають (деякі штами мають мікрокапсулу), нерухливі (джгутиків не мають).

КУЛЬТИВУВАННЯ:факультативні анаероби, температура росту - 37°С, рН середовища - 7,2 - 7,8, вибагливі до живильних середовищ:

Ростуть на: кров'яному агарі, сироватковому агарі, бульйоні Мартена;

- У рідких живильних середовищах(цукровий бульйон, бульйон Мартена) стрептококи ростуть на дні або на стінках пробірки у вигляді пластівців, залишаючи бульйон прозорим;

- На щільних живильних середовищахколонії дрібні або середньої величини, напівпрозорі, мутні, плоскі, блискучі, гладкі сіруватого кольору або зовсім безколірні, які не вростають у живильне середовище і добре знімаються петлею;

- На кров'яному агаріодні стрептококи утворюють зону повного гемолізу (бета-стрептококи), інші - зону зеленого гемолізу (альфа- зеленіючі стрептококи) в результаті переходу оксигемоглобіну в метгемоглобін, інші - не змінюють середовища (гама-стрептококи);

- Гемолітичні стрептококинагадують крапельки роси сіро-білого кольору з характерним злегка піднятим центром;

- Негемолітичні стрептококине реагують з еритроцитами і в процесі свого росту не викликають змін кров'яного агару. ЛАБОРАТОРНА ДІАГНОСТИКА СТРЕПТОКОКА

ХІД ДОСЛІДЖЕННЯ:

І ДЕНЬ

- посів досліджуваного матеріалу на живильні середовища

- виготовлення мазків-препаратів з досліджуваного матеріалу та зафарбовування їх за Грамом.

ІІ день

- виймають чашки з термостата;

- оглядають ріст;

- виділяють чисту культуру, шляхом пересіву на скісний агар.

NB! Гемолітичний стрептококи викликають лізис еритроцитів з утворенням навколо колоній прозорої зони ( повного просвітлення середовища)

ІІІ день.

1. виймають посіви з термостата і оглядають ріст.

2. Перевіряють чистоту культури на скошеному агарі.

3. Роблять мазки, зафарбовують за Грамом і мікроскопують.

4. Ідентифікують чисту культуру:

А)Проводять посів на середовище Гіса з вуглеводами для виявлення цукролітичних властивостей.

Б) Проводять посів чистої культури в молоко, желатин, 40% жовч-для виявлення цукррлітичних властивостей.

NB!Пробірки поміщають в термостат на 18-24 год при t-37^оС.

В) Оглядають бульйон Мартена. Якщо є специфічний ріст (придонно- пристінковий ріст з утворенням дрібного крихтоподібного осаду і прозорим середовищем: зернистий утворює довгі ланцюжки), проводять реакцію преципітації за Ленсфільд для визначення серологічної групи.

Постановка реакції:

Виготовлення групоспецифічних антигенів:

1. Добову культуру, що виросла на бульйоні Мартена, розливають у декілька цетрифужних пробірок.

2. Центрифугують упродовж 10-15 хв при 3 тис. об/хв..

3. Над осадову рідину зливають у банку з дезінфікуючим розчином, а осад заливають стерильним фізіологічним розчином і знову центрифугують 30 хв при 3 тис об/хв..

4. До осаду, зібраного з усіх центрифужних пробірок, додають 0,06 ммоль/л соляної кислоти, виготовленої на 0,85% розчині хлориду натрію, з розрахунку: 0,5 розчину на 10-11 мікробних клітин ( число мікробних клітин визначають за оптичним стандартом мутності).

5. Пробірку поміщають на водяну баню і кип’ятять 15 хв, періодично струшуючи.

6. Отриману завісину знову центрифугують. Антиген при цьому екстрагується у над осадову рідину, яку зливають у чисту пробірку і нейтралізують 1 моль/л розчином гідроксиду натрію до рН 7,0-7,2.

7. Додають індикатор бром тимоловий синій (0,01 мл 0,04% розчину). Під час нейтралізації екстракт із солом’яно-жовтого стає оливково-зелений.

8. Центрифугують, щоб осад звільнився від лугу.

9. Готові екстракти зберігають у холодильнику. При даній реакції колір може змінюватись від оливково-зеленого до голубого.

Хід реакції.

1. В 5 центрифужних пробірок розливають по 0,5 мл анти стрептококових групових сироваток, які готують імунізацією кролів.

2. У першу пробірку вносять сироватку А, в другу – В, в третю – сироватку С, в четверту – сироватку Д, в п’яту – фізіологічний розчин ( контроль).

3. Пастерівською піпеткою в усі пробірки по стінці обережно нашаровують отриманий екстракт (антиген).

Висновок: при додатній реакції у пробірці з гомологічною сироваткою на межі екстракту з сироваткою утворюється тонке молочно-біле кільце ( взаємодія групоспецифічної анти стрептококової сироватки).