Цвета растворов и соответствующих им светофильтров 4 часть

Жидкостно-адсорбционная хроматография широко представлена в двух вариантах: нормально-фазовая (НФХ) и обращенно-фазовая (ОФХ) – в зависимости от полярности подвижной и неподвижной фаз.

В нормально-фазовой хроматографии используют полярный адсорбент (например, силикагель) и неполярный элюент (гексан, хлороформ и др.), а разделяемые вещества – полярные.

В обращенно-фазовой хроматографии, как правило, адсорбент неполярный – силикагель с привитыми на его поверхности алкильными цепями (С₈-С₁₈), элюент полярный (спирты, ацетонитрил, вода), а разделяемые вещества могут быть любой природы. Этим вариантом обращенно-фазовой хроматографии в настоящее время проводят около 2/3 разделений в ВЭЖХ.

Растворители в порядке возрастания полярности располагаются следующим образом: петролейный эфир, циклогексан, тетрахлорметан, бензол, метилхлорид, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, пиридин, ацетон, н- пропанол, этанол, метанол, вода, уксусная кислота.

5.1. ПРИНЦИП АНАЛИЗА МЕТОДОМ ВЭЖХ, ОСНОВНЫЕ УЗЛЫ ХРОМАТОГРАФА И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА

Анализируемую смесь растворяют в ПФ и с помощью дозатора или микрошприца вводят в специальное устройство прибора. Туда же подаётся под определённым давлением и с определённой скоростью ПФ. По мере продвижения ПФ с растворёнными в ней веществами за определённый промежуток времени на колонке происходит разделение смеси.

На рис. 24 представлена блок-схема современного жидкостного хроматографа.

Рис. 25. Блок-схема хроматографа для жидкостной хроматографии при высоком давлении

1 – сосуд для элюента; 2 – насос высокого давления; 3 – устройство для ввода пробы; 4 – хроматографическая колонка; 5 – детектор; 6 – система обработки результатов, самописец.

Рассмотрим подробнее устройство и функции отдельных узлов жидкостного хроматографа.

Насос.Жидкостный хроматограф имеет достаточно сложное градиентное устройство, обеспечивающее отбор элюентов из 2-3 емкостей в смеситель, затем в колонку, а также дозаторы, работающие при высоких давлениях. Элюент должен подаваться в колонку при высоких давлениях, непрерывно и без пульсаций. Для аналитических работ (внутренний диаметр колонок до 5 мм) насосы должны обеспечивать подачу элюента со скоростью от 0,1 до 10 мл/мин при давлении примерно от 200 до 300-500 атм.

Ввод пробы. Пробу вещества вводят в поток элюента с помощью микрошприца через прокладку из специальных ненабухающих полимерных материалов в блок для ввода пробы (дозатор).

Хроматографическая колонка.В качестве колонок используют чаще всего трубки из нержавеющей стали, а также стеклянные трубки длиной 10-25 см. Внутренний диаметр аналитических разделительных колонок составляет обычно 0,4-0,5 см. Они заполняются адсорбентом с диаметром частиц 5-10 мкм сферической или неправильной формы и представляют собой равномерную и плотную упаковку частиц сорбента. Заполнение колонки проводится при давлениях, больших, чем рабочее давление в хроматографе.

В микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей длины и меньшего внутреннего диаметра (0,1-0,2 см и меньше).Частицы адсорбента не должны разрушаться при заполнении колонки под большим давлением. Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5-10 мкм) в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси. Чаще всего разделение проводят в интервале температур 20-50⁰С с точностью ± 0,1⁰ С.

Адсорбент– это пористые частицы с различным размером пор. В качестве сорбента в ВЭЖХ используют чаще тонкоизмельченный силикагель (нормально-фазовая хроматография) или его производные, полученные в результате химической модификации силикагеля (обращенно-фазовая хроматография). Немодифицированный силикагель обладает высокими полярными свойствами. Силикагель с привитыми к поверхности С₈-С₁₈ алкильными или другими функциональными группами обладает поверхностью, специфичной к различным классам разделяемых соединений. В ВЭЖХ в качестве сорбента в колонках часто используют Сепарон С18 (силикагель с привитой алкильной группой с числом углеродных атомов, равным 18).

В качестве подвижной фазы применяют жидкость, обладающую неполярными свойствами, в случае НФХ и полярными при использовании ОФХ . Обычно в качестве ПФ в ОФХ применяют смеси воды и органического модификатора – ацетонитрила, метанола, изопропанола, тетрагидрофурана и др. Вода должна подвергаться специальной очистке и иметь квалификацию “Для хроматографии”.

Состав элюента может быть постоянным на протяжении всей хроматографической процедуры (изократическое элюирование) либо различным в соответствии с установленной программой (градиентное элюирование).Градиентное элюирование – большое достоинство жидкой хроматографии, оно позволяет разделять смеси различной полярности за счет изменения коэффициента распределения.

Температура хроматографических колонок поддерживается постоянной во время выполнения эксперимента, поэтому их помещают в термостат.

Детекторы.Состав элюата, вытекающего из колонки, непрерывно контролируют детектором. Каждый хроматограф должен быть снабжен по крайней мере двумя различными детекторами Чаще всего используются ультрафиолетовый детектор и дифференциальный рефрактометр.

Ультрафиолетовый детектор. Наибольшее распространение в ВЭЖХ получил абсорбционный детектор, работающий в УФ-области или ультрафиолетовый детектор, который проявляет высокую чувствительность ко многим химическим соединениям, отличается удовлетворительной стабильностью, относительной нечувствительностью к изменению температуры и скорости потока, достаточно широким линейным диапазоном и пригоден для решения различных аналитических задач (предел обнаружения составляет несколько нанограммов). Схема кюветы УФ-детектора представлена на рис.26.

Измерительная ячейка заполняется исследуемым раствором. Ячейка сравнения может быть заполнена элюентом или непрерывно промываться им. Объем кювет УФ-детектора – 5-10 мкл.

Полученную информацию обрабатывает компьютер и выдает результаты анализа.

Условия хроматографирования (состав подвижной фазы, сорбент, скорость подачи элюента, размеры колонки, объем вводимой пробы, температурный режим) устанавливаются индивидуально для конкретного анализируемого вещества.

Основной хроматографический параметр - время удерживания, t_r.

Рис. 26. Кювета УФ-детектора

5.2. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗЫ

Идентификацию веществ методом ВЭЖХ проводят по хроматограмме с учётом параметров удерживания компонентов (ранее рассмотрена в разделе “Газожидкостная хроматография”) или по УФ-спектрам.

Например, идентификацию парацетамола в суппозиториях ректальных можно проводить следующим образом:

при прохождении анализируемого и стандартного растворов через кюветы УФ-детектора получают их хроматограммы. При совпадении времен удерживания делают вывод об идентичности веществ, входящих в анализируемые растворы (рис. 27 а, б).

На рис.27 представлена хроматограмма, полученная при анализе цитрамона, имеющего в своем составе парацетамол, кофеин, ацетилсалициловую кислоту. На хроматограмме изображены пики всех указанных ингредиентов и времена их удерживания, соответствующие стандартным образцам.

Количественное содержание индивидуальных веществ или каждого компонента в смеси проводят (см. раздел Количественный анализ, ГЖХ):

· путем сравнения площадей пиков анализируемого и стандартного веществ, полученных в одинаковых условиях;

· методом внутреннего стандарта;

· используя градуировочный график.

5

5.3. СОВРЕМЕННЫЕ ЖИДКОСТНЫЕ ХРОМАТОГРАФЫ

Современные жидкостные хроматографы снабжены микропроцессором и устройствами, с помощью которых можно автоматически производить ввод пробы, поддерживать условия хроматографического процесса по заданной программе, автоматически оптимизировать условия разделения, проводить идентификацию и расчет количественного состава анализируемой смеси по одной или нескольким программам.

В настоящее время для анализов методом ВЭЖХ используют хроматографы серии «Милихром» (Россия), фирмы «Agilent Technologies» (США), Voung Lin Instrument (Корея) и др.

Ниже представлены внешний вид и схема хроматографа «Милихром А-02» (рис.29), внешний вид хроматографа «Милихром 5» (рис.30), внешний вид и характеристики хроматографа «Agilent 1200 » (рис.31).

Высокоэффективный микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» предназначен для работы в стационарных, мобильных или полевых лабораториях, выполняющих анализы качественного состава и количественного содержания веществ для различных отраслей промышленности, медицины, криминалистики, сельского хозяйства, охраны природы, науки.

Рис. 29. Внешний вид и схема хроматографа «Милихром А-02»