Главная Обратная связь

Дисциплины:

Архитектура (936)
Биология (6393)
География (744)
История (25)
Компьютеры (1497)
Кулинария (2184)
Культура (3938)
Литература (5778)
Математика (5918)
Медицина (9278)
Механика (2776)
Образование (13883)
Политика (26404)
Правоведение (321)
Психология (56518)
Религия (1833)
Социология (23400)
Спорт (2350)
Строительство (17942)
Технология (5741)
Транспорт (14634)
Физика (1043)
Философия (440)
Финансы (17336)
Химия (4931)
Экология (6055)
Экономика (9200)
Электроника (7621)






ЭПИДЕМИЧЕСКОГО СЫПНОГО ТИФА И



БОЛЕЗНИ БРИЛЛА (БРИЛЛА-ЦИНССЕРА)

 

(МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ)

 

1. Введение.

Серологические методы являются обязательным разделом лабораторной диагностики сыпнотифозной инфекции и изучения их эпидемиологии. Серологические реакции выполняются с применением видоспецифических антигенов и вследствие своей высокой специфичности имеют решающее значение для подтверждения риккетсиозной природы заболевания.

Предлагаемые методические рекомендации составлены с целью унификации методик исследований с учетом опыта ряда риккетсиозных лабораторий России и зарубежных стран и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения.

Методы серологических исследований, приведенные в методических указаниях, обеспечены коммерческими препаратами.

2. Серологические методы диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла (Брилла-Цинссера).

2.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Позволяет выявить антитела к возбудителю сыпного тифа в ранние, начиная с 5-7-го дня болезни, что придает ей особую ценность. В острый период болезни титры в РНГА колеблются от 1600 до 51200. В основе РНГА лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном.

В основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном или иммуноглобулинами, в присутствии соответствующих групповых антител или антигенов.

2.1.1. РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным диагностикумом.

РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом предназначена для обнаружения и титрования специфических антител риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.

Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном) риккетсий.

К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных) формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических гемагглютининов, последнее может проводиться и неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов реакции используют формалинизированный физиологический раствор (ФФР). Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия (рН=7.0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл раствора хлорида натрия.



Ингредиенты реакции:

1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.

2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.

3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.

4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки.

5) Формалин.

РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл ФФР.

При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.

Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при +56 град. С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее содержимое в 4-12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- и микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. и надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают 30 минут при +37 град. С и центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой истощенную сыворотку, исследуют в РНГА.



Постановка РНГА.

Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки (1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.

Для приготовления последовательных разведений исследуемой сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4 (0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,04 (0,05) мл исходного разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во вторую, из второй переносят в третью 0,4 (0,05) мл и т.д. Из первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку добавляют предварительно хорошо размешанного эритроцитарного диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя соответственно 4-5 или 2-3 часа. Постановка опыта должна сопровождаться следующими контролями:

1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2 (0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25, добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных эритроцитов.

2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.

3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с тест-сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии эритроцитарного диагностикума.

Учет результатов РНГА.

Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение, которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного диагностикума.

Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на "+/-".

2.1.2. РНГА с препаратом на основе нативных эритроцитов.

При отсутствии коммерческого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума РНГА можно ставить с нативными эритроцитами барана, предварительно сенсибилизированными коммерческим антигеном (гаптеном) риккетсий для реакции гемагглютинации. Антиген растворяют в физиологическом растворе (рН=7,0) в соответствии с указаниями на этикетке ампулы. 4 мл растворенного антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана, выдерживают смесь в течение 1 часа при +37 град. С, встряхивая каждые 15 минут, затем центрифугируют 10 минут при 2500-3000 об/мин., надосадочную жидкость отсасывают, а осадок суспендируют в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0), получая 10 мл 1% взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Такой препарат может сохраняться в течение нескольких дней при +4 град. С без снижения активности. РНГА в этом случае ставят на обычном физиологическом растворе (рН=7,0), в остальном подготовка ингредиентов, постановка реакции и учет результатов проводятся точно также, как при использовании сухого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума, за исключением первого разведения исследуемой сыворотки, которое берется не 1:25, а 1:250.

2.2. Метод флуоресцирующих антител.

Метод флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс-метод - сочетает высокую чувствительность люминесцентного анализа с высокой специфичностью иммунологического метода. МФА применяется в лабораторной диагностике с целью выявления риккетсиальных антигенов и антител. Этот метод используют в прямой и непрямой модификации с применением флуоресцирующих конъюгатов, полученных на основе иммуноглобулинов специфических сывороток.

Ингредиенты и оборудование.

1. Риккетсиальные корпускулярные антигены (для МФА).

2. Специфические антириккетсиальные сыворотки.

3. Люминесцирующие специфические риккетсиальные сыворотки.

4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к иммуноглобулинам человека и различного вида животных.

5. Люминесцирующие Fab-фрагменты риккетсиальных антител.

6. Забуференный физиологический раствор рН = 7,2.

7. Спирт 96 град.

8. Ацетон.

9. Дистиллированная вода.

10. Бычий альбумин, меченый родамином или Эванс.

11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л, ЛЮМАМ).

12. Предметные стекла.

13. Чашки Петри.

14. Емкости для промывания стекол.

15. Фильтровальная бумага.

2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.

Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.

Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.

На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37 град. С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Учет результатов реакции.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).

Просматривают не менее 10-20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:

"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;

"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерным для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).

Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;

"++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;

"+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;

"-" - флуоресценция отсутствует.

Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном контроле.

2.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.

Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обечпечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающем в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят, по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцом со срезанным концом.

Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4 град. С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.

Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56 град. С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).

Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37 град. С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37 град. С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.

Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на "+++" или "++++" в предыдущем разведении.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

2.3. Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной, так как дает возможность получения объективных результатов при проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной диагностики.

РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента комплексом антиген-антитело, что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании специфического комплекса антиген-антитело последний связывает комплемент, вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный - феноменом гемолиза эритроцитов.

Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране (Голиневич, 1962):

1) уменьшением объема использованных ингредиентов;

2) упрощением схемы титрования комплемента;

3) получением более достоверных результатов реакции за счет титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).

Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген; 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56-58 град. С (для разрушения содержащимися в ней комплемента и ингибиторов).

Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует рабочему разведению, определенному предприятием-изготовителем.

Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при +30 град. С в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

 

Таблица 1

 

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

 

-------------------+---------------------------------------------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Разведение гемолитической сыворотки ¦

¦ опыта +------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦ ¦1:1000¦1:1200¦1:1600¦1:1800¦1:2000¦1:2400¦1:2800¦1:3000¦1:3200¦1:3600¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Гемолитическая сы-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦воротка (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦3% взвесь бараньих¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦эритроцитов (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Комплемент в раз-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦ведении (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Физ. раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Оценка результатов¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦опыта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

L------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+-------

Титр гемолитической сыворотки 1:1800.

 

Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4 град. С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или каком-либо другом консерванте.

1-я схема постановки РСК.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).

 

Таблица 2

 

-----------------------------+-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦

¦ реакции +---+---T---+---T---+---T---+---T---+

¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Комплемент в разведении 1:10¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Физиологический раствор (мл)¦0,9¦0,8¦0,7¦0,6¦0,5¦0,4¦0,3¦0,2¦0,1¦

L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----

Затем ставят опыт титрования комплемента.

 

Таблица 3

 

-----------------------------+-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦

¦ реакции +---+---T---+---T---+---T---+---T---+

¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Комплемент в различных дозах¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Антиген (мл) ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Физиологический раствор (мл)¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Гемолитическая система (мл) ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Оценка результатов ¦4+ ¦3+ ¦2+ ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦

L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37 град. С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).

Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +37 град. С в течение 1 часа.

Постановка основного опыта.

1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и комплемента в рабочих дозах.

К каждому опыту ставят следующие контроли:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);

5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;

6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п. 5 контроль сывороток в исходных разведениях.

После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при +37 град. С на 1 час.

2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.

2-я схема постановки РСК (по Fiset).

Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4 град. С 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше +/-20 град. С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).

Титрование комплемента.

Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).

 

Таблица 4

 

-----------------------------+-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Разведения комплемента ¦

¦ +-----+-----T-----+-----T----+------+

¦ ¦1:15 ¦1:18 ¦1:20 ¦1:25 ¦1:30¦и т.д.¦

+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+

¦Комплемент 1:10 (мл) ¦ 1 ¦ 1 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ ¦

+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+

¦Физиологический раствор (мл)¦ 0,5 ¦ 0,8 ¦ 0,5 ¦ 0,75¦1,0 ¦ ¦

L----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+-------

Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).

 

Таблица 5

 

----------------------------+------------------------------------

¦ Ингредиенты реакции ¦ Разведение комплемента ¦

+---------------------------+------------------------------------+

¦ Контрольный ряд (оценка качества комплемента) ¦

+---------------------------+----T----+----T----+----T----+------+

¦ ¦1:10¦1:15¦1:18¦1:20¦1:25¦1:30¦и т.д.¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Физиологический раствор¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Гемолитическая система (мл)¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦ Опытный ряд (оценка антикомплементарных свойств антигена) ¦

+---------------------------+----T----+----T----+----T----+------+

¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Антиген в рабочей дозе (мл)¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Физиологический раствор¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Гемолитическая система <*> ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦+++ ¦ ¦

L---------------------------+----+----+----+----+----+----+-------

--------------------------------

<*> Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16-18 часов экспозиции при температуре + 4 град. С).

 

Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.

После 30-минутной экспозиции при температуре +37 град. С учитывают результаты.

При постановке реакции "холодным методом" (0 град. С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 мл, поскольку в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок необходимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.

В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.

При постановке реакции при +37 град. С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т.е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.

В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при +37 град. С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе + 0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37 град. С) для контроля используют 2 последние дозы.

Постановка основного опыта.

Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистероловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1} контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

2} контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

3} контроль комплемента (как указано выше);

4} контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при 0 град. С на 16-20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).

 

Таблица 6

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК

 

------------+-------------------------------------+-----T-----+-----T-----

¦ ¦ Разведение сывороток ¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦

¦Ингредиенты¦ ¦роль ¦роль ¦роль ¦роль ¦

¦ реакции +----+----T----+----T-----+-----T-----+сыв. ¦анти-¦ком- ¦гем. ¦

¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:160¦1:320¦1:640¦ ¦гена ¦плем.¦сист.¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ 1-й этап ¦

+-----------+----T----+----T----+-----T-----+-----T-----+-----T-----+-----+

¦Сыворотка ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Антиген ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Комплемент ¦ ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Физиологи- ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,2 ¦ - ¦

¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ Экспозиция 16-20 часов при + 4 град. С ¦

+-------------------------------------------------------------------------+

¦ 2-й этап ¦

+-----------+----T----+----T----+-----T-----+-----T-----+-----T-----+-----+

¦Гемолитиче-¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦ская систе-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ма (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Физиологи- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦

¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ Экспозиция 20-30 минут при + 37 град. С ¦

L--------------------------------------------------------------------------

 

На втором этапе в каждую пробирку или лунку панелей добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при + 37 град. С 30 минут. Пробирки или панели тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях. В пробирки с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Оценка главного опыта заключается в степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз. Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся задержкой гемолиза не менее чем на три креста.

Результаты реакции считают достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и рабочей дозе комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует. Диагностический титр может считаться 1:10 при условии нарастания титра в 4 раза (и более) с интервалом в 7 дней.

В РСК оба ингредиента используются в дозе, равной 1 ЕД. Дозы определяют путем перекрестного ("шахматного") титрования.

2.4. Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека (РА).

Реакция агглютинации (РА) является наиболее простым тестом и может быть применена для лабораторной диагностики не только сыпного тифа, но и большинства риккетсиозов. Вместе с тем для ее постановки необходимы дорогостоящие тщательно очищенные корпускулярные риккетсиальные антигены.

Ее преимуществом является минимальное число компонентов реакции (исследуемая сыворотка и антигенный диагностикум) и более раннее выявление агглютининов.

Метод обладает, вместе с тем, существенными недостатками:

1) для исследований пригодны только свежие негемолизированные сыворотки, хранящиеся не более 14 дней;

2) затруднена ретроспективная диагностика, поскольку агглютинины выявляются менее продолжительное время после болезни;

3) в случае использования бесцветного антигена - субъективизм при оценке результатов.

Ингредиенты реакции: 1) исследуемая инактивированная при +56 град. С в течение 30 минут прозрачная, свежая сыворотка, 2) корпускулярный антиген, 3) физиологический раствор.

РАР выполняется в макро- (0,4 мл; 6 капель - по Мосингу) и микровариантах (0,05 мл) всегда объемным способом, что ведет к разбавлению вдвое начального разведения сыворотки (например, сыворотка, разведенная 1:10 в объеме 3 капель, при добавлении антигена в объеме 3-х капель будет иметь разведение 1:20).

Для микроварианта РА используют бесцветные корпускулярные антигены, которые разводят согласно этикетке на ампуле, и жидкий антиген коричневого цвета, приготовленный из риккетсий Провачека, культивируемых в кишечнике вшей (для РАР может быть использован также сухой люминесцирующий диагностикум из риккетсий для ИФРМА).

Постановка РА. Макровариант.

Готовят в агглютинационных пробирках или пластинах последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки с 1:5 в объеме 0,2 мл или 3-х капель. С этой целью вносят во все пробирки, кроме первой, по 0,2 мл физиологического раствора (или по 3 капли). В отдельной пробирке или лунке готовят исходное разведение сыворотки (1:5), т.е. 0,1 мл сыворотки + соответственно 0,4 мл физиологического раствора. Из него 0,2 мл (3 капли) вносят в первую пробирку или лунку, 0,2 мл (3 капли) - во вторую и 0,2 мл (3 капли) - в контрольную. Затем из 2-й пробирки после перемешивания сыворотки и физиологического раствора 0,2 мл (3 капли) переносят в следующую и так до конечного разведения. Первое разведение сыворотки (1:5) после добавления антигена будет соответствовать 1:10, о чем делается надпись на пробирке или лунке.

После окончания разведения всех сывороток во все разведения сывороток добавляют антиген (за исключением контроля сыворотки) по 0,2 мл (3 капли), встряхивают штативы с пробирками или панели (продувая воздух в пластины из пипетки) и оставляют на 16-18 часов при +37 град. С (пластины покрывают стеклом во избежание подсыхания ингредиентов).

Постановка РА предусматривает контроль каждой исследуемой сыворотки: 0,2 мл (3 капли) начального ее разведения + 0,2 мл (3 капли) растворителя; контроль антигена: 0,2 мл (3 капли) антигена + 0,2 мл (3 капли) растворителя, а также ставят контроль стандартной специфической сыворотки с известным титром антител. Последнюю разводят на одно разведение выше указанного на этикетке титра (табл. 7).

 

Таблица 7

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

 

---------------+-------------------------------------+-----------

¦ Ингредиенты ¦ Разведения исследуемой сыворотки ¦ Контроли ¦

¦ +----+----T----+----T-----+-----T-----+-----+-----+

¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:160¦1:320¦1:640¦сыво-¦анти-¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ротки¦гена ¦

+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Сыворотка (мл)¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦

+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Антиген (мл) ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦

+--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Физ. раствор ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

L--------------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+------

 

После термостата штативы выдерживают два часа при комнатной температуре, не встряхивая пробирки, поскольку образуемый агглютинат имеет вид нежного перевернутого зонтика и очень легко разрушается. После этого учитывают результаты реакции.

Учет результатов.

Результаты реакции учитываются невооруженным глазом или с помощью агглютиноскопа по 4-х крестной системе:

- полное просветление жидкости над осадком, имеющим вид перевернутого зонтика - четыре креста (++++);

- неполное просветление жидкости над таким же осадком - три креста (+++);

- мутная жидкость при наличии небольшого зернистого осадка на дне и стенках пробирки - два креста (++);

- мутная жидкость, возможен осадок в виде точки - один крест (+).

Реакция считается положительной при наличии интенсивности агглютинации риккетсий на три креста в конечном разведении; в контролях сывороток и антигена не должно быть агглютинации, а титр стандартной сыворотки должен соответствовать указанному на этикетке (допускается изменение титра на одно разведение).

2.5. Определение специфических антител к риккетсиям Провачека иммуноферментным методом.

Принцип иммуноферментного анализа (ИФА) основан на образовании иммунного комплекса специфических антител с антигеном, иммобилизированном на полистероловом планшете, с последующим его выявлением антивидовым коньюгатом, меченым ферментом. Ферментативная активность пропорциональна содержанию специфических антител в сыворотке и проявляется при помощи субстратов для данного фермента.

Иммуноферментный метод обладает рядом существенных преимуществ перед традиционными иммунологическими реакциями, главным из которых является высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, исследование сильно загрязненных образцов, возможность автоматизации всех этапов постановки.

Метод ИФА применяют для серодиагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла, как наиболее чувствительный и позволяющий выявить инфекцию независимо от ее клинической выраженности.

1.Ингредиенты реакции, необходимые для постановки ИФА.

1.1. Коммерческие цельнорастворимые антигены р. Провачека для РСК.

1.2. Положительная сыпнотифозная контрольная сыворотка человека (К+).

1.3. Сыворотки людей, не содержащие антигены к риккетсиям Провачека (К-).

1.4. Буфер адсорбции или присоединения, рН 9,5-9,7

1.5. Буфер инкубации или разведения, рН 7,2-7,4

1.6. Буфер промывки, рН 7,2-7,4

1.7. Субстрат - индикаторный раствор, рН 5,5-6,0

1.8. Антивидовой конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой, сухие (производство НИИЭМ им. Гамалеи РАМН)

1.9. Серная кислота (H2SO4).

2. Оборудование.

2.1. Пипетки стеклянные на 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл.

2.2. Микропипетки стеклянные на 0,1 мл, 0,2 мл.

2.3. Автоматические пипетки Р-20 (на 20 мкл), Р-200 (на 200 мкл), Р-1000 (на 1000 мкл).

2.4. Химические колбы и пробирки.

2.5. Бутылки на 3 л и 5 л.

2.6. Весы технические с разновесами.

2.7. Весы торзионные или аналитические с разновесами.

2.8. рНметр.

2.9. Резиновые груши.

2.10. Планшеты для иммунологических реакций однократного применения.

2.11. Холодильник бытовой.

2.12. Бумага фильтровальная.

2.13. Термостат.

2.14. Фотометр.

3. Реактивы.

3.1. Карбонат натрия (Na2CO3)

3.2. Бикарбонат натрия (NaHCO3)

3.3. Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaH2PO4x2H2O).

3.4. Натрий фосфорнокислый двузамещенный (NaHPO4x12H2O).

3.5. Хлористый натрий (NaCl).

3.6. Твин 20.

3.7. Лимонная кислота.

3.8. 3% раствор перекиси водорода (Н2О2).

3.9. Орто-фенилендиамин (ОФД).

3.10. 1н раствор серной кислоты (H2SO4).

3.11. Вода дистиллированная.

Подготовка ингредиентов реакции.

Антиген разводят в 0,05М карбонат - бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7 (буфер присоединения) в раститровке. Рабочее разведение подбирают "шахматным" титрованием антигена, антител (положительного и отрицательного контроля) и конъюгата.

Для каждой новой серии антивидового конъюгата, антигена или при смене полистероловых планшетов одной фирмы на другую необходимо снова опытным путем ("шахматное" титрование) подобрать оптимальные разведения антигена и конъюгата, которые станут рабочими. Сыворотки разводят в 0,02М фосфатно-солевом буфере, рН 7,2-7,4 содержащем, 0,1% детергента (твин 20) для уменьшения неспецифической реакции (буфер инкубации). В качестве буфера промывки используют буфер инкубации.

Антивидовой конъюгат разводят в 0,02М фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,1% твин 20 и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифической сорбции конъюгата на полистирол, сенсибилизированный антигеном. Необходимо помнить, что при разведении конъюгата перемешивать раствор надо осторожно, не вспенивая его, так как это приведет к денатурации фермента.

Субстрат для пероксидазы (ОФД) разводят в 0,1М цитратно-фосфатном буфере рН5.5-6,0 незадолго до использования не более чем за 30-60 минут до использования.

Все буферные растворы готовят заранее и хранят при температуре +4 град. С. Буфер с твином не хранится на холоде и используется в тот же день при комнатной температуре. Исходный раствор коммерческого цельнорастворимого антигена в стерильном физрастворе хранят около месяца при температуре +4 град. С.

К исходному раствору коммерческого конъюгата (антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой) добавляют равный объем стерильного глицерина, в качестве антифриза и хранят на холоде -10 град. С до срока годности, указанного на ампуле.

Пероксидаза отличается способностью активировать перекись водорода таким образом, чтобы она в присутствии окисляющихся веществ (ОФД) отдала им один атом кислорода. В отсутствие окисляющихся веществ, пероксидаза не разлагает перекись водорода. Поэтому активность пероксидазы определяют в среде, содержащей 0,04% ОФД и 0,04% перекиси водорода в 0,1М цитратно-фосфатном буфере рН 5,5-6,0, инкубируя в течение 30 минут, реакцию останавливают добавлением равного объема 1Н серной кислоты, определяя оптическую плотность при 492нм на фотометре.

Готовят субстрат-индикаторный раствор непосредственно перед внесением на планшет, добавляя в раствор ОФД в 0,1М цитратно-фосфатном буфере рН 5,5-6,0 свежеприготовленную из пергидроли (33%-50%) 3% перекись водорода, перемешивают и быстро разливают в лунки планшета, после чего планшет помещают в темное место, или тщательно прикрывают, оставляя инкубироваться при комнатной температуре. Оставшийся субстрат-индикаторный раствор должен оставаться бесцветным в течение 30 минут при комнатной температуре. Если раствор субстрата начинает менять окраску в желтый цвет различных оттенков (от светло-желтого до коричнево-оранжевого), это говорит об окислении ОФД разлагающейся перекисью водорода под воздействием шероховатой, плохо промытой от щелочи стеклянной посуды. Необходимо отметить, что при длительном хранении перекиси водорода в стеклянной емкости происходит ее медленное разложение под влиянием следов щелочи, которые попадают в раствор вследствие растворения стекла. Чистые, без всяких добавок, растворы перекиси водорода сохраняют в парафинированных сосудах при комнатной температуре, в этих условиях скорость разложения перекиси водорода равна нулю.

Постановка реакции.

В лунки планшета вносят коммерческий антиген в раститровке или в рабочем разведении по 0,1 мл (100 мкл).

Планшеты закрывают крышкой и оставляют на 16-18 часов при +4 град. С (это можно сделать за день до всего объема работы) или помещают в термостат при +37 град. С на 2 часа для сенсибилизации лунок планшета антигеном.

Содержимое лунок интенсивно встряхивают, а лунки заливают до верха буфером промывки, содержащим 0,1% твин-20. Инкубируют 5 минут при комнатной температуре, встряхивают, подсушивают, интенсивно постучав о фильтровальную бумагу, и вновь повторяют процедуру промывки (3 раза).

После последней промывки планшет тщательно высушивают, интенсивно постукивая о фильтровальную бумагу (или чистое полотенце), так чтобы на дне лунок не оставалось влаги.

Вносят двукратное разведение сывороток, начиная с диагностического титра 1:500 по 0,05 мл (50 мкл). Желательно работать с параллелями, внося одно разведение не менее чем в две лунки.

Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37 град. С) на 1 час. В течение этого времени происходит образование иммунного комплекса антиген-антитело.

Содержимое лунок встряхивают и промывают, как указано в п. 5.3.

Вносят антивидовой конъюгат (антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой) в рабочем разведении или в раститровке в лунки планшета по 0,05 мл (50 мкл). Конъюгат разводят в буфере инкубации, содержащем 0,1% твин-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифической сорбции конъюгата на иммунный комплекс антиген-антитело.

Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37 град. С) на 30 минут. При этом происходит специфическое присоединение трех молекул антивидового конъюгата к Fc фрагменту антитела в иммунном комплексе антиген-антитело.

Содержимое лунок встряхивают, промывают 3-4 раза дистиллированной водой, заливая лунки до верха и сразу встряхивая без инкубации, а затем провести процедуру промывки как в п. 5.3. желательно по 3-4 раза по 5 минут.

Во все лунки тщательно высушенного планшета вносят субстрат - индикаторный раствор по 0,05 (50 мкл).

Планшет оставляют в темноте при комнатной температуре в течение 20-30 минут. За это время происходит окисление ОФД перекисью водорода, катализируемое ферментом (пероксидазой), и окраска содержимого лунок меняется от бесцветного до желтовато-коричневой, темно-коричневой различной интенсивности (в зависимости от концентрации фермента в присоединившемся конъюгате к комплексу антиген-антитело).

Реакцию останавливают внесением 0,05 мл (50 мкл) 1Н серной кислоты. Оценивать реакцию можно как визуально, так и инструментально на фотометре при длине волны 492 нм.

Контроли.

"Негативный" контроль-сыворотка людей, содержащая неспецифические антитела, (заведомо отрицательная), в диагностическом титре 1:500.

"Позитивный" контроль-сыворотка людей, содержащая специфические антитела (заведомо положительная), в раститровке начиная с диагностического титра 1:500.

Контроль субстрата-субстрат - индикаторный раствор без антигена, сыворотки и антивидового конъюгата.

На каждый из контролей отводят две лунки. Необходимо ставить все контроли на каждом планшете любого опыта.

Учет результатов реакции.

Реакцию учитывают в том случае, если интенсивность окрашивания "позитивного" контроля превышает не менее чем вдвое окраску "негативного" контроля в том же разведении. Также оценивают и испытуемые сыворотки, сравнивая их окрашивание с окрашиванием "негативного" контроля в диагностическом титре 1:500. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее наибольшее разведение сыворотки, превышающее в 2 раза интенсивность "негативного" контроля. Обычно положительная проба имеет на глаз желто-коричневую окраску различной интенсивности в отличие от бесцветной или слегка желтоватой "негативного" контроля. Реакцию можно оценивать как визуально, так и инструментально на фотометре при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ОП), за положительный результат принимают то разведение нетитруемой сыворотки, которое дает превышение оптической плотности "негативного" контроля в диагностическом титре 1:500 в 2 и более раз.

Для сывороток больных с диагнозом "болезнь Брилла" обычно характерны титры 1:64000-1:256000, тогда как титры людей, выявленных ретроспективно - 1:500-1:64000.

Состав буферов и растворов.

1. Буфер адсорбции или присоединения (покрывающий буфер) 0,02М карбонат - бикарбонатный буфер (КББ) рН 9,5-9,7

Na2Co3 - 1,18 g

NaHCO3 - 3,47 g

Разбавить дистиллированной водой до 1000 мл.

2. 0,02М фосфатно-солевой буфер (ФСБ), рН 7,2-7,4

Na2HPO4x12H2O - 17,9 g

NaH2PO4x2H2O - 0,78 g

NaCl - 42,5 g

Разбавить дистиллированной водой до 5000 мл.

3. Буфер инкубации или разведенная, рН7,2-7,4

а) 0,02М ФСБ б) 0,02М ФСБ

твин-20 - 0,01% твин-20 - 0,01% + 1% БСА

4. Буфер отмывки, рН 7,2-7,5

0,02 ФСБ

твин-20 - 0,01%

5. 0,1М цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ), рН5,5-6,0

6,4 мл 0,2М Na2HPO4x12H2O (17,9 г на 250 мл дист. воды)

6,1 мл 0,1М лимонной кислоты (5,255 г на 250 мл дист. воды)

12,5 мл дистиллированной воды.

6. Субстрат-индикаторный раствор

25,0 мл 0,1М ЦФБ

9-10 мг орто-фенилендиамина

0,35 мл 3% перекиси водорода

7. 1Н раствор серной кислоты (H2SO4). Готовят из концентрированной серной кислоты 16Н H2SO4

10 мл концентрированной H2SO4 растворить

в 150 мл дистиллированной воды.

Приготовление растворов.

Приготовление забуференного физиологического раствора.

В 1 л физиологического раствора (0,87% раствор хлористого натрия) растворить 1,513 г фосфорнокислого двузамещенного натрия и 0,204 г фосфорнокислого однозамещенного калия. рН забуференного физиологического раствора должен быть 7,4-7,5.

Приготовление вероналового буфера.

В мерный литровый флакон добавляют 200 мл буфера, затем наполняют флакон до литровой отметки раствором желатины и тщательно перемешивают. Измеряют рН.

Приготовление раствора буфера.

В 2-х литровый флакон добавляют 1,5 л дистиллированной воды

83,0 г NaCl

10,19 г Na-5,5-диэтилбарбитурата

Перемешивают до полного растворения. Добавляют:

34,58 мл 1 М HCl и перемешивают

5,0 мл раствора MgCl2 CaCl2

Затем добавляют дистиллированную воду до отметки 2 литра и перемешивают.

Готовят разведения буфера 1:5 и измеряют рН.

Приготовление раствора MgCl2 CaCl2

В 250 мл флакон наливают 100 мл дистиллированной воды

Добавляют: 20,3 г MgCl2 4,4 г CaCl2

Перемешивают.

Приготовление водного раствора желатины.

В сосуд емкостью 1 л наливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют 1 г желатины. Кипятят. Охлаждают при комнатной температуре и добавляют 700 мл дистиллированной воды (срок хранения - 1 неделя).

Приготовление формалинизированного физиологического раствора.

в 1 л физиологического раствора добавить 3 мл 40% формальдегида.

Консерванты.

Консервант для комплемента.

Жидкий комплемент хранят при температуре - 20 град. С либо консервируют химическими смесями: 0,05 г сернокислого натрия и 0,04 г кристаллической борной кислоты на 1 мл сыворотки (Гинзбург, Калинина, 1947).

Консерванты для эритроцитов.

1) Консервант крови N 7Б. Выпускается Саранским заводом медицинских препаратов в стерильных стеклянных флаконах емкостью 250 мл. Консерванта во флаконе - 50 мл. Консервирование эритроцитов проводят путем непосредственного соединения взятой от барана крови с консервантом.

2) Раствор "Глюгицир". Представляет собой глюкозо-цитратный раствор N 7б без левомицетина. Выпускается Пензенским заводом медицинских препаратов в стеклянных флаконах. Консерванта во флаконе - 75 мл.

Взятие и обработка крови для серологических реакций.

Для серологических реакций предпочтительнее брать кровь из пальца. Кровь из пальца берут следующим образом:

Кожу пальца (предпочтительно 4-го левой руки) протирают спиртом или эфиром и слегка подсушивают. Иглой или пером для оспопрививания наносят резкий укол в мякоть пальца, появившуюся первую каплю крови удаляют тампоном, а затем легким, ритмичным сжатием пальца с боковых поверхностей выдавливают несколько капель крови. Кровь набирают градуированной пипеткой (1 мл или 2 мл) и переносят в приготовленную стерильную пробирку, которую рекомендуется держать наклонно для получения скошенной поверхности крови. Необходимый объем крови - 1-1,5 мл. Пробирки с кровью помещают в термостат для образования сгустка. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или тонкой прокаленной и остуженной проволокой, бактериологической петлей или осторожным поколачиванием пробирки о ладонь). Пробирки с кровью помещают в рефрижератор или прохладное место для образования и отстаивания сыворотки.

На следующий день на кровяном сгустке образуется прозрачная, желтоватого цвета сыворотка, которую отделяют от сгустка в стерильную пробирку. Сыворотка не должна содержать эритроцитов! При условии срочного получения сыворотки последняя отделяется от сгустка спустя 1-2 часа после его образования с помощью центрифугирования.

На пробирке с кровью должен быть указан или регистрационный номер больного, включающий сведения из журнала о его фамилии, имени, возрасте, дате взятия крови, дне болезни и диагнозе, или перечисленные сведения пишутся на этикетке, наклеенной на пробирку с кровью.

В случае, когда предполагается осложнение в получении нужного количества крови (1 мл), например, у детей, кровь забирают в пробирки, содержащие стерильный физиологический раствор с 0,25% лимоннокислым натрием (99,75 мл физиологического раствора + 0,25 мл лимоннокислого натрия).

В этом случае объем взятой крови может быть сокращен до 0,4 мл. В пробирки предварительно набирают 1,8 мл раствора, препятствующего свертыванию крови, вносят 0,4 мл.

Хранение и транспортировка сывороток.

Разрушение сывороточных белков происходит в результате тепловой их денатурации, протеолиза или при изменении рН-растворов. Полное сохранение свойств сывороток (имеются в виду иммунные глобулины) обеспечивается при содержании их в замороженном (-70 град. С) или высушенном (под вакуумом) состоянии.

Риккетсиальные сыворотки, подлежащие исследованию на протяжении 7-14 дней, рекомендуется хранить при +4 град. С в ампулах, под резиновыми пробками в пробирках (можно ватными, но пропитанными парафином) во избежание высыхания сывороток. На более длительные сроки хранения сыворотки рекомендуется замораживать при -20 град. С (рекомендация научной группы ВОЗ), если отсутствуют условия для создания более низких температур (-70 град. или -196 град. С). Размораживают сыворотки при +37 град. С.

Проверенным способом хранения риккетсиальных сывороток является их лиофилизация. По имеющимся наблюдениям в лиофилизированных сыворотках уровни титров антител не изменяются на протяжении до 15 лет хранения при +4 град. С.

Высушенные на бумаге сыворотки пригодны для серодиагностики (в РСК) сыпного тифа, крысиного сыпного тифа, лихорадки Ку и риккетсиозов клещевой группы на протяжении до полутора месяцев их хранения при +18-37 град. С.

Транспортировку сывороток, высушенных на бумаге, осуществляют в двойных конвертах по почте. Жидкие сыворотки в ампулах или лиофилизированные упаковывают в бумажные салфетки или вату и пересылают по почте бандеролями. Наилучший метод транспортировки жидких сывороток в сосудах (термосах с сухим льдом или контейнерах с жидким азотом - объем контейнера 9,4 л вмещает 180 пробирок) автотранспортом. При пересылке проб в лабораторию извещают телеграммой о номере рейса, номере квитанции, дате, времени отправки и прибытия самолета.

 

Руководитель

Департамента госсанэпиднадзора

А.А.МОНИСОВ

 


Приложение N 4

к приказу Министерства

здравоохранения

Российской Федерации

от 26 ноября 1998 г. N 342

 


Эта страница нарушает авторские права

allrefrs.ru - 2018 год. Все права принадлежат их авторам!